结构生物学技术综述｜MicroED、冷冻电镜SPA与X射线晶体学如何优势互补

       结构生物学是以分子生物学，生物化学和生物物理学为基础的学科，研究工具为生物大分子，如卵白质和核酸等。目的是利用生物或物理手段来看清楚生物大分子的精细形态，以论述生物大分子行驶功效的机制，资助生物学家更好的认识生命运动的历程。并且，许多药物分子的作用靶点大多为卵白质，所以结构生物学在药物研发中起到重要指导作用，为机理研究到药物开发带来清晰的认识。

       针对生物大分子中的卵白质的研究，主要的研究手段有：核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、X射线晶体学（X-ray crystallography）和冷冻电子显微镜（cryo-electron microscope, cryo-EM）。核磁共振主要针对溶液中的、分子量很小（约20kDa）的样品类型，最近几年已使用未几。近年来，也泛起了一些新技术，微晶电子衍射（MicroED）是一种利用冷冻电镜解析微小晶体结构的技术，由于电子束与物质的作用远强于X射线，可以解析X射线晶体学难以处理的纳米晶体结构。特别是关于以往难以培养单晶的卵白样品来说，MicroED为结构生物学家提供了一个前景辽阔的新工具，弥补现有技术的缺乏。该技术被《Science》杂志评为2018年十大突破技术之一。

|   X射线衍射——最富古板意义的结构解析方法

       早在1895 年，伦琴（W. C. Roentgen）就发明了X射线。X射线的发明推动了现代生物学的生长，甚至可以说对整个科学技术领域爆发了极为深刻的影响。1912 年，劳厄（M. V. Laue）与弗里德里希（W. Friedrich）以及伦琴的博士研究生克里平（P. Knipping）利用 X 射线对硫酸铜晶体进行衍射实验，并在底片上获得了一些粗大的、椭圆形的黑点，发明了 X 射线晶体衍射。此后，他们又对ZnS、 PbS、 NaCl 等晶体进行 X 射线衍射实验，获得了清晰的四重对称衍射图。劳厄还提出了 Laue 方程来描述晶体的 X 射线衍射。ZnS 晶体的 X 射线衍射照片宣布不久，布拉格（W. L. Bragg）重复此实验，并在1913年推导出了 X 射线衍射方程，即著名的布拉格方程。X 射线衍射的发明和劳厄方程以及布拉格方程的建立标记着 X 射线晶体学的降生。到1957年，X射线晶体学就解析获得了cq9电子个生物大分子——抹香鲸肌红卵白的结构。而到现在为止，约有十五万的生物大分子结构是利用X射线晶体学解析的。X射线晶体学解析卵白质三维结构之所以生长如此迅速，主要是因为有以下几点优势：1.能够抵达很高的区分率，接近原子水平；2.对卵白质的巨细和成份类型没有限制，所以无论是分子量超大的多亚基复合物照旧分子量很小的多肽，都能通过此要领获得理想结果。但此要领必须有高质量的大尺寸晶体作为前提，所以其第二点优势同时是其限制所在，获得质量较好的晶体关于分子量巨大或者结构柔性的工具来说往往较为困难。

|   基于冷冻电子显微镜的单颗粒剖析技术

       近几十年，冷冻电子显微镜生长迅速，在结构生物学领域逐渐发挥出举足轻重的作用。早在1939年，西门子公司制造了世界上cq9电子台商业化的电子显微镜。为了避免高真空及强烈的电子轰击对样品的破坏，人们用重金属染色或糖包埋的要领处理样品。但由于都对样品进行了破坏性处理且都是在常温条件下进行视察，所以区分率都受到了限制。到1984年，J.Dubochet等人生长了冷冻生物样品的要领并总结了获得玻璃态冰的要领^1,2，这是最早的快速冷冻技术（cryo-freezing）并开启了“冷冻” 电子显微镜时代。通过将生物大分子的溶液样品快速投入至冷却到液氮温度的液态乙烷中，获得冰层厚度合适的冷冻样品，然后对冰层中均匀漫衍的生物大分子颗粒进行拍照，获得上千张照片。通过算法对拍到的二维照片进行剖析，最终获得其结构，此要领称之为单颗粒剖析技术（single particle analysis）。近些年，随着直接电子探测相机（direct detection device, DDD）的泛起和种种数据处理软件的生长，冷冻电子显微镜解析的生物大分子三维结构所占比例越来越大（见图1）。好比2020年3月宣布在Science杂志的研究通过冷冻电子显微镜单颗粒剖析技术，确定了与胰高血糖素及差别类别的异源三聚体G卵白（Gs或Gi1）结合的人源胰高血糖素受体（GCGR）3.7 ?和3.9 ?的结构（见图2）。该研究的多个结构与药理学数据相结合，为II型糖尿病和肥胖症的治疗提供了重要见解³。

图1 冷冻电子显微镜解析的生物大分子三维结构数目的变革趋势

图2 Glucagon-GCGR-GS-Nb35和glucagon-GCGR-Gi1-Scfv16的冷冻电镜结构

       单颗粒剖析技术不需要获得晶体且样品使用量很是少，这使得针对难以结晶的膜卵白或大分子复合物的研究成为可能。然而，虽然单颗粒剖析技术对样品要求量较低，却没有降低对样品均一性的高要求。并且，虽然随着探测器和算法的不绝提升，单颗粒剖析技术已经能够获得区分率2?以内的结构4，但仍然是相对个例，其区分率普遍照旧在3?左右。不过，人类之所以能创立文明，就在于对神秘自然、科学真相永无止境的探索；而各研究领域的不绝生长推进，势必会相互影响、相互增进。

|   MicroED: 晶体学与冷冻电子显微镜在今世的完美糅合

        在电子显微镜生长初期，X射线晶体学技术正蓬勃生长；此时，也正处于衍射理论和数据处理要领逐渐成熟之时。电子晶体学就是电子显微镜技术与晶体学结合的产品。在2007年，斯德哥尔摩大学的科学家智慧地将晶体学和电镜相结合，用冷冻电镜去看晶体，生长出了一项重要的新技术——MicroED (Micro electron diffraction)。MicroED主要是通过电子对微小的晶体进行衍射，然后收集电子衍射数据并进行卵白质结构解析的要领。由于电子的波是非，则受物质散射强（原子对电子的散射能比 X 射线强一万倍），所以能够抵达的区分率更高。并且其需要的晶体尺寸很是小，亚微米尺寸的晶体就可以爆发足够高的信噪比衍射信号。这些奇特优势关于那些能够获得微小晶体而尺寸无法优化变大的样品来说，无疑是个好消息。这种技术2018年还被《Science》杂志评为2018年十大技术突破之一。在 MicroED 生长初期，溶菌酶、catalase和 Ca2+-ATPase等模式样品就被解析到原子区分率。厥后MicroED 进一步生长，不再局限于模式样品，还解析了α-synuclein中心肽段和R2lox酶6等未知卵白的结构（见图3），并且区分率都高达~1 ?。2016年后，MicroED生长迅速，解析的卵白质结构的数量也快速增加（见图4），prions和 FUS LC（fused in sarcoma low-complexity domain）等样品的晶体结构都获得了1 ?左右的高区分率（见图4）。此后MicroED解析的工具难度逐渐增加，甚至还包括了复合物和离子通道等膜卵白（见图4）。从2018年开始，人们将MicroED与冷冻聚焦离子束技术（cryo-Focused Ion Beam, cryo-FIB）技术相结合，可以将尺寸稍大但仍不适用与X射线晶体学的晶体剪薄，将适用于MicroED的晶体尺寸规模扩大至几十微米，大大拓宽了MicroED技术的应用规模，填补了MicroED和X射线晶体学之间的空隙。

图3 MicroED解析的R2lox结构

图4 MicroED的研究统计

|   流程简、区分率高、时间短——MicroED翻开结构生物学探索的新方法

        MicroED的原理类似于X射线晶体学。电子波同X射线一样，照射到类似晶体的样品上时也能够爆发衍射现象。当中间镜的物平面位于物镜的后焦面时，将在荧光屏上获得经中间镜和投影镜放大了的电子衍射谱，即为透射电子显微镜的衍射模式。在实际的透射电子显微镜中，成像模式和衍射模式的中间镜电流已设置好，通过相应按钮（Diffraction按钮）即可实现两个模式的切换。MicroED对结构生物学领域起到了很好的增补。

       由于MicroED的奇特优势，除了生物大分子之外，其对化学小分子、天然产品、药物制剂的研究更是再合适不过了。因为化学小分子泛起粉末状，尺寸上与MicroED的研究规模很是契合，并且基本可以在几个小时内从粉末获得其结构信息。许多利用MicroED研究化学小分子的乐成案例都验证了此技术的高效性和应用性（见图6）。MicroED在生物大分子和小分子药物上的研究展示了其在结构生物学领域的巨大应用潜力，为结构生物学家提供了一个前景辽阔的新工具。

图5 MicroED的事情流程⁷

^{图6 MicroED获得的化学小分子及天然产品的案例}7

        总体说来，无论是X射线晶体学与冷冻电镜单颗粒技术，照旧新兴的MicroED技术，都是科学家在不绝实验与优化中逐步推进的。它们在技术和研究规模上相互增补，相互增进，尽最大可能让人类无穷接近自然真相，继续引领生命科学的生长。关于商业化的结构生物学测试效劳，cq9电子公司自拥有MicroED国际先进的测试平台，同时提供SCXRD和CryoEM-SPA的测试效劳。

参考文献：

1. Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J. & McDowall, A. W. Emerging techniques: Cryo-electron microscopy of vitrified biological specimens. Trends in Biochemical Sciences 10, 143-146 (1985).

2. Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J. & McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature 308, 32-36 (1984).

3. Qiao, A. & Han, S. Structural basis of G(s) and G(i) recognition by the human glucagon receptor.   367, 1346-1352 (2020).

4. Yip, K. M. F., N. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.   587, 157-161 (2020).

5. Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G. & Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. Elife 2, e01345 (2013).

6. Xu, H. et al. Solving a new R2lox protein structure by microcrystal electron diffraction. Science Advances 5 (2019).

7. Nguyen, C. & Gonen, T. Beyond protein structure determination with MicroED. Current Opinion in Structural Biology 64, 51-58 (2020).