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原核表达系统(大肠杆菌)中常见内源卵白的去除要领介绍

2022-12-28 分享

       大肠杆菌表达系统具有遗传配景清楚,目的基因表达水平高,培养周期短,本钱低等特点, 是分子生物学研究和生物技术工业化生长进程中的重要工具。我们通过大肠杆菌表达系统合成目的卵白时会碰到的一个问题是,如何去除大肠杆菌自己的卵白(内源性卵白),特别是在目的卵白表达量比较低的情况下。本文主要介绍如何在利用大肠杆菌表达纯化卵白的历程中去除内源性卵白,进而抵达提高目标卵白纯度的目的。

        目前,卵白纯化最常用的要领是亲和层析和离子交换层析。亲和层析是基于生物高分子与配基可逆结合的原理,使配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。主要有:Ni柱亲和层析、GST亲和层析、Protein A亲和层析、FLAG-tag亲和层析、Strep-tag层析和 MBP-tag(麦芽糖结合卵白)层析等。其中最常用的是Ni柱亲和层析和GST亲和层析。它们的操作历程概略相似,都是先平衡再上样,之后洗杂,最终洗脱目的卵白(如图1)。


图 1 亲和层析原理


        大肠杆菌常见的内源性污染卵白有三类。cq9电子类:Fur, Crp, SlyD, ArgE, Cu/Zn-SODM 和YodA,Ni柱纯化洗脱的咪唑浓度大于80mM;第二类:GlmS, ODO2, YadF, CAT, GlgA, Yf bG 和 G6-PD,Ni柱纯化洗脱的咪唑浓度55 和 80 mM 之间;第三类:Hsp60 和ODO1,Ni柱纯化洗脱的咪唑浓度30 和 55 mM。这三类卵白的性质见表1。Ni柱纯化卵白常见的污染卵白是70KDa左右的内源性卵白(YfbG和GlmS),和25KDa左右的内源性卵白(SlyD,Crp和YodA等)。如果目的卵白的含量比较低,70KDa和25KDa的内源性卵白污染就比较难通过Ni纯化去除。


表1. 大肠杆菌Ni纯化常见的内源性污染卵白性质及咪唑洗脱浓度

名称 Uniprot MW %His pI 结合离子 咪唑浓度
YfbG P77398 74.2 4.1 6.3 55-80 mM
GlmS P17169 66.8 3.9 5.5 55-80 mM
Hsp60 AAC77103 57 0.2 4.8 30-50 mM
G6PD P22992 55.7 1.2 5.5 55-80 mM
GlgA P08323 51.7 3.4 6 Mg2+ 55-80 mM
ODO2 P07016 44 1.7 5.5 55-80 mM
ArgE P23908 42.3 4.4 5.5 Fe2+,Ni2+ ≥80 mM
CAT AAA57080 25.5 5.5 5.9 Co2+ 55-80 mM
YadF P36857 25 5.5 6.1 Zn2+,Hg2+ 55-80 mM
Crp P03020 23.6 2.9 8.3 ≥80 mM
YodA P76344 22.3 5.2 5.6 Cd2+,Zn2+ ≥80 mM
SlyD P30856 20.8 10.2 4.8 Zn2+,Ni2+ ≥80 mM
Cu-Zn-SODM AAC74718 17.6 4 5.9 Cu2+Zn2+ ≥80 mM
Fur P06975 16.7 8.1 5.6 Fe2+,Zn2+ ≥80 mM
Hfq P25521 11.1 4.9 6.9 ≥80 mM
ODO1 P07015 10.5 3.6 6 30-50 mM
S15 P02371 10.2 5.6 10.4 ≥80 mM


        下面介绍本公司一个Ni柱纯化卵白的案例。

        案例一,该卵白带有6个His标签,分子量为66.3kDa,pI为7.99。使用Ni柱纯化,将Ni柱洗脱出的各组分进行SDS-PAGE验证。具体结果如图2所示:


图 2 Ni柱纯化SDS-PAGE结果


        通过L和FT比照可以看出,卵白在上样之后,杂卵白很是多,其中也包括一些内源性卵白,但这些内源性卵白与目的卵白没有相互作用或相互作用很弱,因此可以先用低浓度的咪唑来清洗。将20i和250i比照可以看出,清洗之后仍有部分卵白停留在Ni柱上无法与目的卵白离开,可知这些内源性卵白与目的卵白相互作用较强或者与Ni柱的结合比较强,需要使用疏散效果更强的离子柱将它们疏散。 

        离子交换层析是通过带电的溶质分子与介质中可交换的离子进行交换,从而抵达疏散纯化卵白的目的(如图3)。离子交换层析又可分为阴离子层析或阳离子层析,如果目的卵白的等电点(pI)已知,可选择阴离子层析且操作的pH要高于目的卵白的pI,或选择阳离子层析且操作的pH低于目的卵白的pI。



图 3离子柱纯化原理


         与Ni柱纯化差别的是,离子柱需要低盐上样,高盐洗脱。将卵白的盐浓度稀释至50mM左右,再上柱。接纳AKTA进行梯度洗脱时,每次增加100mM的盐浓度,直至将卵白全部洗脱下来。最后进行SDS-PAGE卵白电泳来检察目标卵白的具体出峰位置。在上述案例中,目的卵白pI为7.99,这个pI值不太好选择离子柱,因为卵白纯化用缓冲液一般选择pH值7-8的缓冲液体系。因此, 分子量70KDa巨细的内源性杂蛋(YfbG和GlmS,等电点划分为6.3和5.5),在配制buffer时可以将pH校准至8.0左右, 在此pH值下YfbG和GlmS带负电,可以结合到阴离子柱Q柱上,目的卵白则流穿。 



图 4 案例一 Q柱纯化SDS-PAGE结果


         案例二、Heparin阳离子柱在纯化大肠杆菌卵白时对一些内源性卵白也有较好的疏散效果,以我们公司的一个卵白纯化结果为例(如图5): 

         此案例中目的卵白的pI为8.2,但buffer的pH为7.5,因此卵白无法挂柱。通过图5中的supernatant和flow through可以确认目的卵白全部流穿。再将supernatant和flow through相比,10-15kDa和25-35kDa两处杂卵白全部挂柱。Heparin阳离子柱通常能够把这两处杂卵白全部吸附住,如果目标卵白pI偏高就可以配制pH低于目标卵白pI的buffer,使其流穿,有效去除10-15kDa和25-35kDa这两处的杂卵白。


图 5 Heparin柱纯化SDS-PAGE结果


       在纯化卵白的历程中选择正确的纯化要领能够抵达良好的纯化效果并降低卵白纯化难度,提前查阅了解卵白的信息和性质十分重要,在对纯化卵白有了充分的了解之后就能制定出合适的纯化计划,最终获取高纯度的卵白。

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