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亚胺还原酶 (IREDs)

以结构生物学数据为基础进行半理性设计获得的工业催化用酶。由于没有同源性较高的酶结构供参考,cq9电子接纳重新解析相位的方法完成了该酶的结构数据交付。


配景
亚胺还原酶(IREDs)是依赖NAPDH的酶,可催化亚胺的差池称还原合成手性胺。但IREDs的底物规模很窄,合理的工程设计很是稀有。

2022年,中国科学院微生物研究所高书山团队在国际顶尖学术期刊《Angewandte Chemie》上宣布了一篇关于亚胺还原酶IR-G36结构设计的论文。通过合理空腔设计、组合活性位点饱和度测试(CAST)和热稳定性工程相结合,将活性较弱的IR-G36转化为具有优异性能的变体M5,催化效率提高了4193倍。且M5体现出广泛的底物规模,可用于合成差别的氮杂环烷基胺,并且在工业相关条件下以百克规模证明了该反应。

该文章运用了半理性设计手段对酶进行革新。首先在86个IREDs中进行筛选,筛选出具有最佳R选择性(78%)的IR-G36作为下一步进化的目标。接着运用结构生物学的手段,解析IR-G36的空间结构作为酶革新的依据,最终乐成革新出催化效率大大提高的变体M5。

本研究中关于IREDs结构解析方面的事情由苏州cq9电子科技有限公司提供技术支持。

IREDs,亚胺还原酶,属于卵白质,卵白质结构解析一般有以下办法:
  • 实验结果
    1、卵白表达&纯化
    本研究IR-G36卵白表达使用的表达系统是大肠杆菌表达系统(BL21),卵白纯化办法使用的是Ni-NTA柱纯化,再过一遍凝胶过滤层析。
    图1 凝胶过滤层析和SDS-PAGE结果
  • 2、晶体培养
    本研究使用坐滴法对IR-G36 WT和IR-G36 M5进行结晶。
    图2 IR-G36 WT和变体M5的卵白晶体
  • 3、X射线衍射数据收集
    同步辐射光源收集卵白晶体衍射数据信息。
    图3 晶体衍射图
  • 4、结果解析
    由于IR-G36与已解析的IREDs同源性40%,需要重新解析相位。制备重原子(Se原子)晶体衍生物,通过单波长变态色散法(SAD)确定IR-G36 WT的结构。区分率为2.4 ?。
    图4 IR-G36 WT与辅助因子NADP+复合的三维结构
    以IR-G36 WT的结构作为模型,利用分子置换法确定IR-G36 M5的结构。
    图5 IR-G36 WT(灰色)的结构和IR-G36 M5(小麦色)的结构重叠
  • 参考文献
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